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  岁月如梦

  2022-10-29

  肿瘤细胞的原代培养：由于不同人种、不同民族的遗传基因不同，所以对不同疾病， 特别是对复杂疾病的易感性、对各种药物的耐受性和对各种环境因子的反应也不同，建立国人肿瘤细胞株， 可为国人疾病的诊断、防治及药物开发提供肿瘤模型。
  （一）材料与设备
  1. 无菌材料眼科剪，眼科镂， 一次性培养皿，细胞培养瓶T25 、T75 , 冻存管，一次性小滤器， 一次性离心15~50ml， 高糖DMEM 培养液， 1% 1V型胶原酶，青／链霉素，胎牛血清，二甲基亚砜，冻存液。
  2. 设备超净操作柜／台、CO2 培养箱、4 ℃ 冰箱、－70°C 冰箱、离心机、相差显缴镜及照相设备。
  （二）操作步骤
  无菌条件下，取肿瘤手术切除的肿瘤组织，置于50ml 含双倍双抗试液D-Hanks溶液的离心管中，并尽快运输到实验室，尽快进行以下操作。
  1． 在超净操作台中，将肿瘤组织从离心管中移出，在10cm 的培养皿内，将脂肪、出血部分剔除，将肿瘤组织块用D-Hanks 溶液（含双倍的双抗试液）清洗干净，将组织移入另一无菌培养皿内。
  2. 用无菌剪刀将组织剪碎至2~3 mm3 大小，用D-Hanks 溶液将剪好的组织块清洗2 次，然后将组织块移入15ml 离心管中，经350g 离心8min 后，弃去上清液，加3ml IV型胶原酶混匀， 37°C 水浴15min, 每5min 震荡1 次。
  3. 当酶液变混浊时（在显微镜下可见大量游离细胞） ，轻吸上清液移入另一无菌离心管并加入含血清的高糖DMEM培养液终止反应。
  4 . 未消化完的组织块再加入新鲜消化液，重复此步骤2~3 次，直至大部分细胞被消化下来，消化好的细胞悬液混匀，经350g 离心8min, 弃去上清液，并用D-Hanks 溶液洗涤2 次。
  5. 将细胞溶解于8ml 高糖DMEM 完全培养液中，接种于T25 细胞培养瓶中。
  6. 细胞培养在37°C 、5% CO2 培养箱中， 48h 后换液，弃掉未贴壁细胞。每2~3d 换液1 次，待细胞长满后传代培养。
  7. 在细胞扩增到不同代数时，可将部分细胞的进行冻存。一方面尽早保存一些细胞，便于日后对比观察、鉴定，另一方面可做些储备，以防微生物污染或发生细胞交叉污染。
  （三）细胞形态学鉴定
  将细胞接种在直径10cm 培养皿中的盖玻片上至细胞汇合（放入5% CO2 、95% 湿度的培养箱中培养），根据需要作CK、HE 等染色。
  （四）试剂的配制
  1. 抗生素的配制   青霉素和链霉素， 一般配制浓度均10000U/ml 和10000μg/ml，用无菌的D-Hanks 溶液或生理盐水溶解，分装小瓶， 5ml/瓶， －20℃ 冰箱保存备用。用时每100ml 完全培养液加1ml双抗试液（每毫升培养液含宵霉素100U/链霉素100μg ）。
  2. 完全培养液的配制   高糖DMEM 培养液＋ 10％胎牛血清＋1％双抗试液。
  3. 冻存液的配制   30％的胎牛血清， 5％的二甲基亚砜，分装， －20℃冰箱保存备用。使用时1ml 可冻存一管。
  （五）小结
  1. 做好详细的实验记录。
  2. 注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。
  3. 细胞每传7~8 代冻存1 批，并记录清楚代数。
  4. 20 次以后，进行全面鉴定。

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  风华依旧

  2022-10-29

  视神经星状胶质细胞的培养：
  随着细胞培养技术的不断改进，虽然正常细胞难于培养成活，科研人员还是不断研究各种正常细胞的培养方法。到目前为止，几乎体内各种组织细胞均可在体外成功培养。越来越多的研究工作可应用体外培养的正常细胞作为模型开展工作。神经胶质细胞的成功培养最早由Raff 等完成。视神经胶质细胞的培养开始于1990 年，先后有多个实验室培养成功。视神经胶质细胞参与眼部多种疾病的发生、发展。视神经胶质细胞可在体外传代培养， 并具备相应功能。该细胞可用于其生物学的基础研究、临床研究，并可作为探讨视神经发病机制、治疗措施的基础，也可作为表达神经胶质细胞特异蛋白、因子等生物制品的工具。视神经周围的星状胶质细胞，在眼部多种疾病发生中，均有重要作用。利用体外培养的视神经星状胶质细胞在研究药物作用机制及将来筛选新药中有重要意义。
  （一）材料与设备
  1. 材料4~7d 的新生Wistar 大鼠。
  2. 试剂培养液、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶／0.04％胶原酶、消化液、100μg/ml 的多聚赖氨酸、0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 消化液。
  3. 设备培养皿、移液器、枪头、盖玻片、细胞计数板、离心管、超净工作台、CO2 培养箱、倒置显微镜、离心机、解剖显微镜。
  （二）试剂配制
  1. L– 多聚赖氨酸(0.1mg/ml)    用于包被培养皿。取L－多聚赖氨酸10mg 加到100ml 0.01mol/L PBS (pH 7.4) 中溶解并用0.22μm 的微孔滤器除菌。
  2. 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 消化液
  (1) 取0.5g 胰蛋白酶置玛瑙研钵中，先放入少量D-Hanks 溶液研磨20min 以上，之后再溶于450ml D-Hanks 溶液中。
  (2) 在450ml D-Hanks 溶液中加入0.2g EDTA （乙二胺四乙酸）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH 调节溶液的pH 至8.0, 于37°C 水浴中溶解。
  (3) 将（1）、（2）混合，用D-Hanks 溶液定容至1L (pH 8.0) ，并用0.22μm的微孔滤器过滤除菌分装，－20℃ 保存备用。
  注意，须加入NaOH 将溶液的pH 调至接近8.0 时， EDTA 才能完全溶解。
  3. 0.25％胰蛋白酶消化液   取0.25g 胰蛋白酶在玛瑙研钵中先放少量D-Hanks 溶液研磨20min 以上，之后再用D-Hanks 溶液定容至100ml ，并用0.22μm的微孔滤器过滤除菌。
  4. 0.04％胶原酶消化液取40mg 的胶原酶溶于100ml D-Hanks 溶液中，并用0.22μm 的微孔滤器过滤除菌。
  （三）操作步骤
  1 ．细胞的分离培养。在解剖显微镜下分离视神经管到视交叉后1 ~2mm, 切除视神经。
  2. 用MEM-EBSS 含HEPES (0.02mol/L) 液洗2~3 次，置于无菌培养皿中剪碎。
  3. 先用等容积的0.25％胰蛋白酶和终浓度为0.02％的胶原酶37°C 消化15min，以每分钟1 000 转的速率离心10min, 重复2 次。
  4. 再用0.05％胰蛋白酶/0.02%EDTA 消化液37°C 静置消化15min, 取出摇晃一下再继续消化15min, 以每分钟1 000 转的速率离心10min, 弃去上清液。
  5. 加入含1.7％牛血清白蛋白、10％胎牛血清的DMEM 培养液通过21G 针头(0.8mm) 6~7 次。过筛网，细胞悬液用含20％胎牛血清的DMEM 培养液终止消化。以每分钟1 000 转的速率离心5min, 收集细胞。
  6. 用含20％胎牛血消 、青霉素(100U/ml) 、链霉素(100μg/ml）DEME 培养液重新悬浮细胞，分别移入用100μg/ml 的多聚赖氨酸或2％明胶包被过的培养皿中。
  7. 置7% CO2 培养箱内，在37°C 条件下培养，根据细胞贴壁情况， 1 周后换液。待细胞接近汇合，用常规消化方法以 1: 2 方式传代。
  （四）细胞鉴定
  神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillar acid protein, GFAP) 细胞免疫组化鉴定，显示星状细胞胞质内有棕色阳性产物， 细胞核不着色， 核膜清晰
  （五）注意事项
  1. 用L－ 多聚赖氨酸( 0.1mg/ml ) 包被培养板后， 要待其干后先用D-Hanks溶液漂洗2 次再接种， 因为其对细胞有毒性。L－多聚赖氨酸( 0.1mg/ml ) 能回收再利用。
  2 . 其他  幼鼠比成年鼠更易成功。